การกลายพันธุ์ Bacillus subtilis TISTR 25 เพื่อเพิ่มการผลิตแอลคาไลน์โปรตีเอส

Abstract

งานวิจัยนี้จะเป็นการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสของ Bacillus subtilis TISTR 25 โดยการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ด้วยแสงอัลตราไวโอเลตและสารเคมี NTG โดยทำการคัดเลือกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ขั้นปฐมภูมิใช้โพเทนซีอินเดกช์ (Potency Index) ซึ่งตรวจดูบริเวณใสรอบ ๆ โคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี Skim Milk และเตตร้าไซคลิน จากนั้นทำการคัดเลือกขั้นทุติยภูมิโดยวิเคราะห์แอคดิวิดีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสในน้ำหมักโดยใช้เคซีนเป็นซับสเตรทพบว่าโพเทนซีอินเดกซ์มีความสัมพันธ์กับแอคดิวิตีแอลคาไลน์โปรตีนเอสเป็นแบบเส้นตรงฝจากการฉายแสงอัลตราไวโอเลต 20 นา ถึง 2 ครั้ง ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร ที่ยะระห่างจากแสง 20 เซนติเมตร มีเปอร์เซ็นต์รอด 0.1 เปอร์เซ็นต์และใช้ความเข้มข้น NTG ปริมาณ 25 ปริมาณ 25 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ทำการกลายพันธุ์ 2 ครั้ง ผลการทดลองทำให้ได้สายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 ที่สามารถผลิตแอคติวิดีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสสูงขึ้นกว่า Bacillus subtilis TISTR 25 ถึง 81.80 เปอร์เซ็นต์ ในการทดสอบการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสในระดับขวดเขย่า พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 พบว่าอยู่ที่ pH 9.5 และอุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ซึ่งแตกต่างจาก Bacillus subtilis TISTR 25 ตรง pH ของการทำงานของแอลคาไลน์โปรตีนเอสเท่านั้น เมื่อทำการทดสอบประสิทธิภาพการผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอส ในถังหมักขนาด5 ลิตร ของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 พบว่า สามารถผลิตแอลคาไลน์โปรตีนเอสได้สูงถึง 640.15 ยูนิตต่อมิลลิลิตร หลังการเพาะเลี้ยง 60 ชั่วโมงในอาหารที่มีวัตถุดิบผสมระหว่างกากถั่วเหลืองกับเมล็ดทานตะวัน เป็นแหล่งไนโตรเจน ซึ่งมีไนโตรเจน 0.3 กรัมเปอร์เซ็นต์ และแป้งมันสำปะหลัง 0.5 เปอร์เซ็นต์ เป็นแหล่งคาร์บอน หลังจากนั้นทำการผลิตเอนไซม์ผลแอลคาไลน์โปรตีนเอสโดยวิธีตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต 70 เปอร์เซ็นต์และอบแห้งที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส พบว่าแอคดิวิดีจำเพาะของสายพันธุ์ใหม่ UUNN-1 เท่ากับ 709.91 ยูนิตต่อมิลลิลิตรต่อมิลลิกรัมโปรตีน และมีแอคติวิตีที่สูงกว่า Bacillus subtilis TISTR 25 ถึง 85.25 เปอร์เซ็นต์ เมื่อทดสอบแอคติวิตีของแอลคาไลน์โปรตีนเอสผงอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 60 วัน ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 37 องศาเซลเซียส สามารถเก็บได้โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตีเลย