Genome wide characterization of unmethylated line-1 MAP : the implication as tumor marker

Abstract

งานนี้เป็นการวิจัยต่อเนื่องจากการผลการศึกษาก่อนหน้าด้วยเทคนิค Combined Bisulfite Restriction Analysis ที่ตำแหน่ง 5’UTR หรือ โปรโมเตอร์ของ LINE-1s (COBRA-L1) ซึ่ง L 1s เป็น active intersperse repetitive retrotransposible elements ที่สำคัญทั้งนี้ก็เพื่อคาดการณ์ลักษณะการลดลงของเมทิเลชั่นทั่วทั้งจีโนม (Genome) มะเร็ง (Global genomic hypomethylation) และจากผลการทดลองก็พบความแตกต่างของเมทิชั่นทั้งจีโนมระหว่างเนื้อเยื่อชนิดต่าง ๆ และพบการลดลงของเมทิเลชั่นอย่างชัดเจนในมะเร็งหลายชนิด จุดมุ่งหมายของการศึกษาในงานวิจัยนี้ก็เพื่อการอธิบายลักษณะการลดลงของเมทิเลชั่นในระหว่างการเกิดมะเร็งแบบหลายขั้นตอน (multistep carcinogenesis) ของ L1 แบบ full length ที่เลือกมา 17 ตำแหน่ง โดยทั้งหมดอยู่ในบริเวณ intron ของยีน เนื่องจากเทคนิค COBRA-L1 แสดงให้เห็นความแตกต่างระหว่างเนื้อเยื่อชนิดต่าง ๆ ได้ จึงเป็นที่น่าสนใจในกรณีการเปรียบเทียบลักษณะเมทิเลชั่นของ L1 แต่ละตำแหน่งต่อไป เทคนิค COBRA unique sequence to L1 (CU-L1) ประยุกต์เทคนิค COBRA-l ด้วยการใช้ปลายด้าน 5’ เป็น unique sequence ที่อยู่เหนือจาก L1 ไปทาง 5’ แทนการใช้ส่วน 5’UTR ของ L1 แบบเดิม พบความสัมพันธ์อย่างสูงระหว่างค่าเมทิเลชั่นของ COBRA-L1 กับ ค่าเฉลี่ยระดับเมทิเลชั่นของ CU-L1 โดยได้ค่า pearson correlation คือ 0.913 (sig.2-tailed <0.01) เมื่อเปรียบเทียบ Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines และ HNSCC microdissected tissues กับกลุ่ม normal oral epithelial พบว่า ผล CU-L1 15 จาก 17 ตำแหน่งสามารถแสดงการลดลงของเมทิเลชั่น (hypomethylation) (P<0.01) แต่ในกลุ่ม leukaemic cell lines จะไม่พบการแสดงการลดลงของเมทิเลชั่น (P>0.05) นอกเหนือจากนั้น พบว่ามี CU-L1 9 ตำแหน่ง ได้แก่ PRKG1, LOC133993, CNTNAP5, LRP2, LOC286094, FAM49A, ADAMTS20, COL24A1 และ SPOCK3 ที่สามารถแสดงความแตกต่างระหว่าง normal oral epithelial และ normal white blood cell (P<0.05) ที่น่าสนใจก็คือพบว่า CU-L1 หลายตำแหน่งสามารถใช้แสดงลักษณะ clonal expansion ซึ่งถือเป็นคุณสมบัติทางพันธุกรรมที่สำคัญของมะเร็ง และสำหรับ CU-L1 บางตำแหน่งก็มีลักษณะการลดลงของเมทิเลชั่นสูงเกือบ 100% ในขณะที่บางตำแหน่งก็มีแต่การเพิ่มเมทิเลชั่น (Hypermethylation) และที่เหนือความคาดหมายก็คือการพบว่าการลดลงของเมทิเลชั่นที่ 2 intronic L1 ของยีน EPHA3 และที่ 1 intronic L1 ของ PPP2R2B มีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณ mRNA ทั้ง 2 ยีน (ค่า Pearson correlation 0.703, 0.724 และ 0.630 ตามลำดับและทั้งหมดมี P<0.05). โดยสรุปจากเดิมที่รู้ว่าเนื้อเยื่อและมะเร็งมีระดับเมทิเลชั่นหลากหลายและจำเพาะ ในที่นี้ก็ได้พิสูจน์ให้เห็นว่า L1 แต่ละตำแหน่งก็มีการบทบาทในกระบวนการ epigenetics ต่างกัน บางตำแหน่งก็แสดงความแตกต่างระหว่างเนื้อเยื่อ และที่สำคัญก็คือ L1หลายตำแหน่งมีบทบาทสำคัญทางชีววิทยาในการพัฒนาของมะเร็ง และสำหรับกลไกการลดลงของเมทิเลชั่นบน L1 ที่มีผลให้ยีนหยุดการทำงาน จะเป็นแนวทางสำคัญในการช่วยให้เข้าใจบทบาทของ Global hypomethylation ในการพัฒนาของมะเร็งแบบหลายขั้นตอน