ภาวะเหมาะสมเพื่อการผลิตไลเปส โดย Bacillus spp.

Abstract

การผลิตเอนไซม์ไลเปสจากเชื้อ Bacillus subtilis โดยการคัดเลือกสูตรอาหารที่เหมาะสมในการใช้เป็นสูตรอาหารที่ดีที่สุดของการเลี้ยงเชื้อ ผลการทดลองพบว่า สูตรอาหารที่ประกอบด้วยสูตรพื้นฐานที่ 1, สารสกัดจากยีสต์ 0.5% (w/v), แอมโมเนียมไนเตรท 0.2% (w/v) และน้ำมันละหุ่ง 0.33% (v/v) เป็นสูตรอาหารที่เหมาะสมและให้แอคติวีตีของเอนไซม์สูงสุด โดยกำหนดให้ภาวะการเลี้ยงเชื้อในสูตรอาหารดังกล่าวคือ ความเร็วรอบในการเขย่าให้อากาศ 200 รอบต่อนาที, เชื้อเริ่มต้นมีความขุ่นเมื่อวัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 600 nm เท่ากับ 0.1, pH เริ่มต้นในการเลี้ยงเชื้อเท่ากับ 6.8, อุณหภูมิ 30ํซ และเวลาในการเลี้ยงเชื้อ 6 ชั่วโมง เมื่อทำการติดตามการทำงานของไลเปสที่หลั่งออกมาจากเชื้อ Bacillus subtilis พบว่า เวลาในการบ่ม 30 นาที, ปริมาณเอนไซม์ 0.5 มิลลิลิตร, อุณหภูมิ 45 ํซ, อะซิเตทบัฟเฟอร์ที่ pH 4.8, และใช้อิมัลชันของน้ำมันมะกอก 1% เป็นซับสเตรท เป็นภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการติดตามการทำงานของเอนไซม์ นอกจากนี้เอนไซม์ไลเปสยังถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์โดย EDTA และ HgCl2 และถูกยับยั้งบางส่วนด้วย NiCl2 และ FeCl3 ได้ทำการทดลองเพื่อใช้วัตถุดิบที่มีในประเทศไทยทดแทนแหล่งคาร์บอนและแหล่งไนโตรเจนที่ใช้ในสูตรอาหารเลี้ยงเชื้อโดยพบว่ากลูโคสหรือฟรุคโตส 1% (w/v) เพียงอย่างเดียวสามารถทดแทนน้ำมันละหุ่ง 0.33% (v/v) ได้ นอกจากนี้กากถั่วเหลือง ที่มีเปอร์เซนต์ไนโตรเจนทั้งหมด 0.3% สามารถใช้ทดแทนสารสกัดจากยีสต์ 0.5% (w/v) ที่มีเปอร์เซนต์ไนโตรเจนทั้งหมด 0.18% ได้ หลังจากนั้นทำการตกตะกอนน้ำใสจากน้ำเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยสูตรอาหารที่ดีที่สุดของการเลี้ยงเชื้อด้วยเอธานอลความเข้มข้น 80% (v/v) และอบแห้งที่อุณหภูมิห้อง (25 ํซ) เป็นเวลา 8-12 ชั่วโมง จะได้เอนไซม์ในสภาพผงที่มีแอคติวิตี 6.5 ยูนิต/มิลลิกรัม โปรตีนในการนำผงเอนไซม์ไปทดสอบการเก็บรักษาที่อุณหภูมิระหว่าง -20 ํซ ถึง 60 ํซ พบว่าที่อุณหภูมิ 20 ํซ ถึง 30 ํซ สามารถเก็บรักษาเอนไซม์ไว้ได้อย่างน้อย 28 วัน โดยไม่สูญเสียแอคติวิตีของเอนไซม์เลย