การพัฒนาชุดตรวจวิเคราะห์โพรเจสเทอโรนในน้ำนมโคด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมิวโนซอร์เบนด์แอสเสย์ : รายงานการวิจัย

Abstract

โพรเจสเทอโรนเป็นสเตอรอยด์ฮอร์โมน (C21 steroid, pregn-4-ene-3, 20 dione) ซึ่งถูกผลิตและหลั่งมาอยู่ในน้าเลือดและน้านมโดยคอร์ปัสลูเทียมหลังจากการตกไข่ระหว่างวงรอบการเป็นสัด เป็นที่ทราบกันว่าระดับความเข้มข้นของโพรเจสเทอโรนสามารถใช้ระบุการเข้าสู่วงรอบการเป็นสัดและการตั้งครรภ์ของโคได้โดยมีความถูกต้องอยู่ที่ 75 – 96% ดังนั้นวิธีการตรวจหาทางระบบภูมิคุ้มกันจึงได้รับการพัฒนาและนาไปใช้ในการตรวจหาระดับฮอร์โมนโพรเจสเทอโรน โดยการใช้เทคนิค enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ซึ่งถือว่าเป็น หนึ่งในวิธีการที่เหมาะสมที่สุด เนื่องจากให้ ความไวสูง สามารถทาได้ง่าย และมีความจาเพาะสูง ในการศึกษานี้ได้พัฒนาชุดตรวจแบบ antibody-captured competitive ELISA โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี โคลน 5/G7-F4 ที่ถูกสร้างมาจากการใช้โพรเจสเทอโรน 3-(o-carboxymethyl) oxime (P3-CMO) ในการกระตุ้น มาตรวจโพรเจสเทอโรนในรูป P3-CMO และ P4 (pregn-4-ene-3, 20 dione) จากการทดลองพบว่าความไวของการตรวจในรูปค่าความเข้มข้นในการยับยั้งที่ 50% ( IC50) และค่าขีดจากัดในการตรวจวัด (LOD) สาหรับโพรเจสเทอโรน P3-CMO มีค่า 2.18 และ 0.12 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลาดับ ในขณะที่การตรวจโพรเจสเทอโรน P4 มีค่าเท่ากับ 4.85 และ 0.5 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลาดับ ผลที่ได้นี้ ชี้ให้เห็นว่า ELISA ที่พัฒนาขึ้นมีความไวสูงพอที่จะใช้ตรวจโพรเจสเทอโรนในระหว่างรอบการเป็นสัดและการตั้งครรภ์ ( มีค่าโดยประมาณระหว่าง 1 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร และ 25 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร) ต่อมาจึงได้นา ELISA ที่พัฒนาขึ้นไปตรวจโพรเจสเทอโรน (P3-CMO) ที่ถูกเติมลงใน skim milk โดยค่าความถูกต้องของการตรวจจะแสดงในรูปของค่าร้อยละของการนากลับ (%recovery) และค่าความแม่นยาของการตรวจจะแสดงในรูปของร้อยละของสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวน ( %coefficient of variation, % CV) ซึ่งพบว่ามีค่า 85-103 % และ 0.01-0.18 % ตามลาดับ จากการหาค่า %CV ของการวิเคราะห์ในการทดลองเดียวกัน (intra-variation assay) และระหว่างการทดลอง (inter-variation assay) พบว่ามีค่าอยู่ในช่วง 0.04-1 % และ 0.01-0.18 % ตามลาดับ เมื่อนา ELISA ที่พัฒนาขึ้นมาตรวจโพรเจสเทอโรนในรูป P4 ในส่วนไขมันหลัก (core fat) ที่สกัดจากน้านมดิบพบว่ามีค่าค่าร้อยละของการนากลับและร้อยละของสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวนอยู่ในช่วง 80%-118% และ 0.03%-3.33% ตามลาดับ โดยปริมาณโพรเจสเทอโรนที่ตรวจควรมีค่าอยู่ในช่วง 1-100 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร จากนั้นได้ใช้ ELISA ที่พัฒนาขึ้นตรวจปริมาณโพรเจสเทอโรนในน้านมโคดิบจากพระราชวังสวนจิตรลดา พบว่า สามารถตรวจสอบปริมาณโพรเจสเทอโรนที่อยู่ใน core fat และ skim milk ได้ แต่ปริมาณที่ตรวจได้จะให้ค่าสูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการตรวจด้วยชุดตรวจสอบทางการค้า อย่างไรก็ตามชุดตรวจที่พัฒนาขึ้นสามารถใช้บอกระดับการเพิ่มขึ้นหรือลดลงของโพรเจสเทอโรนในแต่ละวันได้สอดคล้องกับชุดตรวจสอบทางการค้า จากผลการทดลองชี้ให้เห็นว่า ELISA ที่พัฒนาขึ้นสามารถนามาใช้ในการตรวจสอบฮอร์โมนโพรเจสเทอโรนในนมดิบได้โดยมีความถูกต้องและแม่นยาอยู่ในช่วงที่ยอมรับได้