การพัฒนาระบบขนถ่ายดีเอ็นเอโดยใช้อนุภาคนาโนไคโทซานและการเหนี่ยวนำให้เกิดกระบวนการออโต้ฟาจีในเซลล์นำเสนอแอนติเจน : โครงการวิจัย

ธนาภัทร ปาลกะ

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/57365

Title:	การพัฒนาระบบขนถ่ายดีเอ็นเอโดยใช้อนุภาคนาโนไคโทซานและการเหนี่ยวนำให้เกิดกระบวนการออโต้ฟาจีในเซลล์นำเสนอแอนติเจน : โครงการวิจัย
Other Titles:	Development of DNA delivery system using chitosan nanoparticle and induction of autophagy in antigen presenting cells
Authors:	ธนาภัทร ปาลกะ
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Subjects:	ไคโตแซน อนุภาคนาโน วัสดุทางการแพทย์ Chitosan Nanoparticles Biomedical materials DNA vaccines Transfection
Issue Date:	2554
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	การทรานสเฟคชันโดยการนำพลาสมิดที่มีชิ้นยีนแทรกสอดเข้าสู่เซลล์เป็นขั้นตอนสำคัญในการประยุกต์ใช้งานด้านชีวเวชศาสตร์ เช่น การทำยีนบำบัด และวัคซีนชนิดดีเอ็นเอ เซลล์ส่วนใหญ่รับพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ด้วยประสิทธิภาพที่ต่างกัน เซลล์นำเสนอแอนติเจน (Antigen Presenting Cell; APC) เช่น เซลล์เดนไดรติกและแมโครฟาจ เป็นหนึ่งในเซลล์ที่นำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ยากที่สุด เซลล์เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการนำเสนอแอนติเจนต่อเฮลเปอร์ทีลิมโฟไซต์เพื่อชักนำให้มีการตอบสนองแบบ adaptive อย่างมีประสิทธิภาพ ในการที่จะกระตุ้นภูมิคุ้มกันได้อย่างมีประสิทธิภาพหลังจากการปลูกวัคซีนนั้น สามารถที่จะมุ่งเป้าแอนติเจนไปยังเซลล์นำเสนอแอนติเจน วัคซีนชนิดดีเอ็นเอเป็นวัคซีนชนิดใหม่ที่มีศักยภาพที่จะทดแทนวัคซีนที่มีใช้อยู่ในปัจจุบันได้ จากเหตุผลในด้านความง่ายในการเตรียม ความเสถียรและราคาต้นทุนที่ถูก โดยทั่วไปวัคซีนชนิดดีเอ็นเอจะให้ทาง intradermal หรือ intramuscular และเชื่อกันว่าเซลล์ใด ๆ ก็สามารถนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ การมุ่งเป้าวัคซีนชนิดดีเอ็นเอไปยังเซลล์จำเพาะชนิดแบบจำเพาะนั้นเป็นสิ่งที่พึงประสงค์ในการเหนี่ยวนำการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่ดีที่สุด ออโต้ฟาจีเป็นกลไกป้องกันการรุกรานของเชื้อก่อโรคในระดับเซลล์โดยจะกำจัดแอนติเจนภายในเซลล์ รวมถึงเชื้อก่อโรคแอนติเจนที่เป็นโปรตีนที่ผ่านการย่อยจะถูกนำเสนอแก่เฮลเปอร์ทีลิมโฟไซต์ ดังนั้น ในงานวิจัยนี้ผู้วิจัยจึงมีวัตถุประสงค์ในการพัฒนาระบบนำส่งดีเอ็นเอพลาสมิดที่มุ่งเป้าไปยัง APC โดยใช้อนุภาคนาโนจากไคโทซานและผนวกระบบการเหนี่ยวนำออโต้ฟาจีเมื่อให้นำส่งดีเอ็นเอแล้วโดยใช้พลาสมิดเหนี่ยวนำออโต้ฟาจี ก่อนอื่นผู้วิจัยได้หาภาวะที่เหมาะสมในการทรานสเฟคชันโดยใช้ไคโทซานละลายได้ในกรดในการห่อหุ้มพลาสมิดในระดับ in vitro ที่สัดส่วน N/P ที่ 8:1-10:1 ให้อัตราการทรานสเฟคชันเข้าเซลล์สูงสุดใน HEK293T ผู้วิจัยได้ดัดแปรไคโทชานให้มี strepavidin และใช้ในการห่อหุ้มพลาสมิด หลังจากนั้นนำไคโทซาน strepavidin-พลาสมิดไปบ่มกับ biotinylated anti-F4/80 antibody ซึ่งจำเพาะต่อโมเลกุลบนผิวเซลล์แมโครฟาจ ซึ่งพบว่าไคโทซานดัดแปรนี้มีบ่มร่วมกับ biotinylated anti-F4/80 antibody ไม่สามารถเพิ่มอัตราการทรานสเฟคชัยเข้าเซลล์ไลน์แมโครฟาจ RAW264.7 ได้ การศึกษานี้จึงบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อหาภาวะที่เหมาะสมในการใช้ไคโทซานดัดแปรให้มี strepavidin เพื่อนำส่งแบบมุ่งเป้าดีเอ็นเอไปยังเซลล์เป้าหมาย อีกทั้งเพื่อเพิ่มการนำเสนอแอนติเจนต่อทีลิมโฟไซต์ผู้วิจัยจึงได้พัฒนาระบบพลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เซลล์เกิดออโต้ฟาจี จากการใช้พลาสมิดที่มียีน mTOR ที่มีการกลายพันธุ์ที่ทำให้ไคเนสของ mTOR เสียแอคติวิตี พบว่าสามารถตรวจหาการเกิดออโต้ฟาจีใน HEK293T และเซลล์ไลน์เดนไดรติก JAWSII ได้ ดังนั้น ระบบการเหนี่ยวนำออโต้ฟาจีจึงได้มีการพัฒนาขึ้น ดังนั้น จึงเป็นไปได้ว่าสามารถใช้วัคซีนชนิดดีเอ็นเอในการกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่แรงโดยการนำเทคนิคนี้มาใช้ร่วมกัน
Other Abstract:	Transfection of plasmid containing an insert into cells is an essential step in various application in biomedicine such as gene therapy and DNA vaccine. Most cells take up plasmids with varying efficacy. Antigen presenting cells (APCs) such as dendritic cells and macrophages are one of the hardest cells to transfect. These cells play important roles in antigen presentation to helper T lymphocytes to initiate effective adaptive immune response. In order to induce effective immune response upon vaccination, antigens can be targeted to antigen presenting cells. DNA vaccine is a novel type of vaccine with potentials to replace currently in use vaccine because of its ease in preparation, stability and cost effectiveness. In general, DNA vaccine is administered via intradermal or intramascullar and believed to be taken up by any cells. Specifically targeting DNA vaccine to specific cells are ideal in order to induce optimal immune response. Autophagy is a cellular defense mechanism to target intracellular antigens, including pathogens. Parts of degraded protein antigens are presented to helper T cells. Therefore, in this study, we aimed at developing DNA plasmid delivery system targeting APCs using chitosan nanoparticles and incorporating autophagy inducing system upon DNA delivery, using autophagy inducing plasmid. First, we optimized the transfection using acid soluble chitosan particles that encapsulated DNA plasmid in vitro. At N/P ratio of 8:1-10:1 yielded the highest transfection rate in HEK293T. We modified chitosan to contain strepavidin and encapsulated plasmid DNA. The step was foolowed by incubation of chitosan-strepavidin-DNA plasmid with biotinylated anti-F4/80 antibody that specifically targeting macrophages. Unexpectedy, modified chitosan incubated with anti-F4/8 antibody did not increase the numbers of transfected macrophage cell line, RAW264.7. These results imply that it is necessary to further study in optimization in using strepavidin-modified chitosan for target cell specific DNA plasmid delivery. In addition, in order to increase antigen presentation to T cells, we developed a DNA plasmid system which induced cells to undergo autophagy. Using plasmid containing mutated mTOR gene encoding inactive mTOR kinase, autophagy could be detected in HeK293T and dendritic cell line, JAWSII. Therefore, autophagy inducing system is established. Combining these techniques, it is possible to use DNA vaccine to induce robust immune response.
Description:	โครงการส่งเสริมการทำงานวิจัยเชิงลึกในสาขาวิชาที่มีศักยภาพสูง
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/57365
Type:	Technical Report
Appears in Collections:	Sci - Research Reports

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
Tanapat pa_b19343577.pdf		1.72 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record