การพัฒนาชุดตรวจด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์เอสเสย์ ของอนุพันธ์ของสารไนโตรฟูแรน:3-อิมิโน-2-ออกซาโซลิดิโนน และ 3-อะมิโน-5-มอร์ฟอลิโนเมทิล-2-ออกซาโซลิดิโนน

Abstract

3-อะมิโน-2-ออกซาโซลิดิโนน (AOZ) และ3-อะมิโน-5-มอร์ฟอลิโนเมทิล-2-ออกซาโซลิดิโนน (AMOZ) เป็นสารเมแทบอไลต์ของฟูราโซลิโดนและฟูรัลทาโดนตามลำดับ ซึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่อยู่ในกลุ่มสารไนโตรฟูแรน ใช้สำหรับป้องกันและรักษาโรคติดเชื้อในสัตว์ อย่างไรก็ตามสารเมแทบอไลต์ทั้งสองถูกจัดว่าเป็นสารก่อมะเร็งและทำให้เกิดการกลายพันธุ์ ซึ่งจะเป็นอันตรายต่อผู้บริโภคได้ ทำให้ต้องกมีการตรวจการตกค้างของสารทั้งสองชนิดในผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ ต่าง ๆ ซึ่งการตรวจสอบด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์เอสเสย์เป็นวิธีที่เหมาะแก่การตรวจคัดกรองตัวอย่างจำนวนมาก ดังนั้นจุดประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อ AOZ และ AMOZ และนำแอนติบอดีที่เหมาะสมไปพัฒนาเป็นชุดตรวจ ELISA โดยได้ทำการกระตุ้นหนูทดลองเพื่อให้สร้างแอนติบอดีต่อสารทั้งสองพบว่า หนูทดลองสามารถสร้างแอนติบอดีที่สามารถจับกับสารในรูปอิสระได้จึงได้ทำการหลอมรวมเซลล์เพื่อเตรียมเซลล์ไฮบริโดมา ในกรณีของ AMOZ ได้ทำการหลอมรวมเซลล์ทั้งหมดจำนวน 5 ครั้งได้โมโนโคลนอลแอนติบอดีจำนวน 21 โคลน จากการศึกษาลักษณะสมบัติขอโมโนโคลนที่คัดเลือกมา 5 โคลน พบว่าไอโซไทป์ของโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 1F22 E5.1 5A7 และ 7H8 เป็น IgG2b และโคลน 4F1 เป็น IgG2a โดยโคลนที่มีความไวสูงสุดคือ 2E5.1 ซึ่งให้ค่า IC50 และ LOD ต่อสารอิสระ AMOZ เท่ากับ 14.98 ppb และ 1.42 ppb ตามลำดับ ซึ่งโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ได้มีความจำเพาะต่อสารอิสระ (CPAMOZ NPAMOZ AMOZ และ FTD และไม่พบการเกิดปฏิกิริยา ข้ามกับสารไนโตรฟูแรนตัวอื่น ๆ และยาปฏิชีวนะตัวอื่น ๆ ที่ใช้ทดสอบ เมื่อนำแอนติบอดีไปเตรียมชุดตรวจ ELISA ในรูปแบบต่าง ๆ พบว่า รูปแบบของ Antibody captured indirect competitive ELISA (Streptavidin-HRP) ให้ค่า LOD(0.06 ppb) ต่ำที่สุดและต่ำกว่าค่า MRPL (0.3 ppb) จึงเลือกรูปแบบนี้มาทำการประเมินประสิทธิภาพโดยใช้ตัวอย่างเนื้อกุ้งที่เติมสาร AMOZ ลงไปพบว่าสำหรับ intra-variation assay จะได้ค่า %CV อยู่ในช่วง 16.1-0.03% และ %recovery อยู่ในช่วง 80.4-124% แต่เมื่อความเข้มข้นของสารที่เติมลงไปต่ำกว่า 0.3 ppb (ค่า MRPL) ค่า %CV จะมีค่าสูงว่า 20% ในส่วนของ inter-variation assay จะได้ค่า%CVอยู่ในช่วง 0.01-7.43% และ %recovery อยู่ในช่วง 72.5-157% และจากการวิเคราะห์ปริมาณเปรียบเทียบโดยใช้ชุดตรวจ ELISA ต้นแบบและ LC/MS-MS พบว่าการวิเคราะห์ทั้งสองวิธีให้ผลที่ใกล้เคียงกันโดยมีค่า r² เท่ากับ 0.9809 แสดงว่าชุดตรวจสอบต้นแบบสามารถใช้วิเคราะห์ AMOZ ได้อย่างมีความถูกต้องและแม่นยำ ส่วนในกรณีของ AOZ สามารถเตรียมโมโนโคลนได้ 2 โคลนจากการหลอมรวม 5 ครั้ง แต่จากทำการศึกษาลักษณะสมบัติของแอนติบอดีที่ได้พบว่าแอนติบอดีต่อ AOZ ที่ได้มีความไวไม่เพียงพอต่อการใช้งาน จึงไม่เหมาะแก่การนำไปพัฒนาเป็นชุดตรวจต้นแบบ