การใช้ RFLPs ของชิ้นส่วนบริเวณ nodD1 และ nodA ของไรโซเบียมถั่วเหลือง ระบุศักยภาพการตรึงไนโตรเจน

กาญจนา ชาญสง่าเวช

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/63728

Title:	การใช้ RFLPs ของชิ้นส่วนบริเวณ nodD1 และ nodA ของไรโซเบียมถั่วเหลือง ระบุศักยภาพการตรึงไนโตรเจน
Other Titles:	Use of nodD1-nodA RFLP patterns of soybean rhizobia to predict nitrogen-fixing potential
Authors:	กาญจนา ชาญสง่าเวช
Email:	ไม่มีข้อมูล
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Subjects:	ถั่วเหลือง ไรโซเบียม การตรึงไนโตรเจน Soybean Rhizobium Nitrogen -- Fixation
Issue Date:	2551
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	ถั่วเหลืองเป็นพืชเศรษฐกิจที่ใช้เป็นอาหารและแปรเป็นผลิตภัณฑ์อื่น เช่น น้ำมันถั่วเหลือง น้ำนมถั่วเหลือง เต้าหู้ เต้าเจี้ยว และซีอิ๊ว นอกจากนี้ เกษตรกรบางรายปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน เพราะที่ปมรากถั่วเหลืองมีแบคทีเรียไรโซเบียม ช่วยเปลี่ยนไนโตรเจนจากอากาศให้เป็นแอมโมเนียให้ถั่วเหลืองใช้ในการเจริญเป็นการลดการใช้ปุ๋ยเคมีเช่น ยูเรีย เกษตรกรในประเทศที่เป็นผู้นำด้านการส่งออกถั่วเหลือง เช่นสหรัฐอเมริกา จึงปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน สลับกับพืชเศรษฐกิจชนิดอื่น เช่น ข้าวโพด เป็นการบำรุงดินอย่างยั่งยืน ปัจจุบันพื้นที่เพาะปลูกถั่วเหลืองในประเทศไทยลดลงเหลือประมาณ 831,000 ไร่ (1 ไร่ เท่ากับ 1,600 ตารางเมตร) เพราะราคาขายเฉลี่ยของถั่วเหลืองต่ำ (12 บาทต่อกิโลกรัม) ทำให้ไม่คุ้มทุนแก่เกษตรกรในการปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน เกษตรกรไทยจึงใช้ปุ๋ยเคมีในการปลูกพืชชนิดอื่นที่ทำรายได้ให้เกษตรกรสูงกว่าถั่วเหลือง เช่น ข้าว ข้าวโพด อ้อย ยางพารา ปาล์ม และมันสำปะหลัง ซึ่งการใช้ปุ๋ยเคมีปริมาณมากและใช้ติดต่อกันเป็นเวลานาน ทำให้ดินขาดความอุดมสมบูรณ์ เนื่องจากการใช้ปุ๋ยเคมีไม่ใช่การบำรุงดินแต่เป็นการอัดธาตุอาหารให้พืช โดยไม่มีการเติมอินทรียวัตถุเพิ่มลงในดิน และการใช้ปุ๋ยเคมียังเร่งอัตราการสลายตัวของอินทรียวัตถุในดิน ให้โครงสร้างของดินเสื่อมลง ดินจึงอัดตัวแน่น ไม่อุ้มน้ำในฤดูแล้ง วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 58 สายพันธุ์กับ RFLP5 ซึ่งในงานวิจัยนี้หมายถึงรูปแบบการเรียงตัวบนอกาโรสเจลของแถบดีเอ็นเอของชิ้นส่วนระหว่างยีน nodD1 และยืน nodA หลังจากตัดด้วยเรสตริกชั่นเอนไซม์ sphl ซึ่งถ้าตรวจพบความสัมพันธ์ดังกล่าว จะสามารถใช้รูปแบบการเรียงตัวหรือ RFLPs ดังกล่าวในการทำนายศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ผลการทดสอบความสามารถของแบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนเร็วที่แยกจากอำเภอชาติตระการ อำเภอพรหมพิราม และอำเภอบางระกำ จังหวัดพิษณุโลก จำนวน 8 สายพันธุ์ที่แยกได้พร้อมกับการแยกไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า และเติมลงในโหลเลียวนาร์ดที่เลี้ยงถั่วเหลืองแต่ละพันธุ์จำนวน 7 พันธุ์ พบว่าแบคทีเรียทั้ง 8 สายพันธุ์ไม่สร้างปมที่รากถั่วเหลือง แบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนเร็วทั้ง 8 สายพันธุ์จึงไม่ใช่ไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนเร็ว ผลการหา RFLP ของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 58 สายพันธุ์ พบว่าไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 45 สายพันธุ์ มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอบริเวณระหว่างยืน nodD1 และยืน nodA ซึ่งแยกโดยวิธี พีซีอาร์โดยใช้ nodYf (5’TGTACGCGGGTAAACC3’) และ nodYr (5’AGCGCAACGAGAAGAT3’) เป็นไพรเมอร์ขนาด 395 คู่เบส และไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 13 สายพันธุ์ มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอดังกล่าวขนาด 350 คู่เบส ทั้งนี้เมื่อแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอออกจากอกาโรสเจลและทำให้ดีเอ็นเอปราศจากสิ่งปนเปื้อนโดยใช้ชุดสำเร็จรูป Nucleospin และตัดชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยเรสตริกชั้นเอนไซม์ sphl ผลการทดลองพบรูปแบบ RFLPs จำนวน 3 รูปแบบ ได้แก่ รูปแบบ A ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 395 คู่เบส รูปแบบ B ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 350 คู่เบส และรูปแบบ C ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 120 และ 275 คู่เบส โดยไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 30, 12, และ 16 สายพันธุ์มี RFLPs รูปแบบ A, B และ C ตามลำดับ ทั้งนี้พบว่าไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าที่มี RFLPS รูปแบบ A, B และ C มีแนวโน้มที่มีจำนวนปมทั้งหมดที่รากในระดับน้อย (1-10 ปมต่อต้น) ถึงระดับปานกลาง (11-20 ปมต่อต้น) ผลการทดลองไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบ RFLPs กับศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ซึ่งหาโดยการใช้น้ำหนักแห้งของลำต้น ในปัจจุบันยังไม่ทราบหน้าที่ของดีเอ็นเอซึ่งอยู่ระหว่าง nodD1 และ nodA ซึ่งได้แก่ nodY ในไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ดังนั้นผลการทดลองที่ไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบ RFLPs ของ nodY กับศักยภาพการเข้าสร้างปมและศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า อาจชี้ให้เห็นว่า nodY อาจไม่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเข้าสร้างปมและกระบวนการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า
Other Abstract:	Soybean is an economic plant which is used as food and feed and is modified into soybean oil, soybean milk, tofu, soybean paste, and soy sauce. In addition, some farmers grow soybean as a rotational crop because there are bacteria rhizobium in soybean root nodules which change nitrogen from the atmosphere into ammonia for soybeans used for growth to reduce the extent of uses of chemical fertilizers such as urea. Farmers in countries which are leading soybean exporters grow soybean in rotation with other economic plants such as corn for sustainable soil maintenance. At present, soybean cultivation areas in Thailand have been reduced to about 831,000 rais (1 rai equals 1,600 sq.m.) because the average sale price for soybean is 12 baht per kilogram. Therefore, Thai farmers tend to use chemical fertilizers to grow plants with higher return for investments, such as rice, corn, sugarcane, rubber plants, palm, and cassava. Continuous usages of large quantities of chemical fertilizers for a long time lead to soil infertility. The practice does not lead to soil fertility since it only adds plant mineral nutrients to soil. Moreover, chemical fertilizer usage lead to an increase in degradation of soil organic matters which leads to deterioration of soil structure resulting in compactness of soil with less water holding capacity during dry periods. The aim of these experiments is to find correlations between nitrogen-fixing potential of 58 strains of slow-growing soybean rhizobia and RFLP patterns of DNA region between nodD1 and nodA genes after cutting with the restriction enzyme sphl. If a correlation is found, the RFLP patterns might be used to predict nitrogen-fixing potential of slow-growing soybean rhizobia. Authentication tests of 8 fast-growing bacteria isolated at the same time as the isolation of the slow growing soybean rhizobia indicated that the strains did not nodulate the 7 cultivars of soybeans used in the authentication tests in Leonard jars. Therefore, they were not fast-growing soybean rhizobia. Amplification of DNA fragments between nodD1 and nodA genes by PCR using nodYf (5’TGTACGCGGGTAAACC3’) and nodYr (5'AGCGCAACGAGAAGAT3’) as the primers showed a 395-bp DNA fragment for 45 slow-growing soybean strains and a 350-bp fragment for the remaining 13 strains. DNA fragments from agarose gels putified by Nucleospin kit restricted with sphl, and separated by agarose gel electrophoresis revealed 3 RFLP patterns or RFLPs. The first RFLP pattern A consisted of a 395 bp fragment, the second RFLP pattern B consisted of a 350 bp fragment, while the third RFLP pattern C consisted of 120 bp and 275 bp fragments. The number of slow-growing soybean rhizobia belonging to RFLP patterns A. B. and C were 30, 12, and 16 strains, respectively. The soybean rhizobium strains with RFLP patterns A. B, and C tended to yield an average total number of root nodules in the low (1-10 nodules per plant) to medium ranges (11-20 nodules per plant). No correlation was found between RFLP patterns and nitrogen fixing potential in the form of plant dry weight. At present, the function of the region between nod/ and nod which constitutes nodY in slow-growing soybean rhizobia is unknown. Based on the no correlations between RFLPs of nodY and levels of nodulation and nitrogen fixation potential obtained from this research, nodY may not have an essential role in nodulation and nitrogen fixation processes.
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/63728
Type:	Technical Report
Appears in Collections:	Sci - Research Reports

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
Kanchana Sa_Res_2551.pdf		4.25 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record