Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/65254
| Title: | ผลของการติดอิพิโทปที่ปลายด้าน N- ของเอนไซม์คาร์บอนิกแอนไฮเดรสไอโซไซม์ II ของมนุษย์ที่มีต่อแอคทิวิตี้ของมันในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae |
| Other Titles: | Effect of N- terminal epitope tagging of human carbonic anhydrase isozyme II on its activity in Saccharomyces cerevisiae |
| Authors: | สหกฤษณ์ เกษจินดา |
| Advisors: | ชุลี ยมภักดี |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | Chulee.Y@Chula.ac.th |
| Issue Date: | 2561 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | คาร์บอนิกแอนไฮเดรส (CA) เป็นเอนไซม์ที่ทำหหน้าที่เร่งปฎิกิริยาแบบผันกลับของคาร์บอนไดออกไซด์ (CO₂) กับน้า (H₂O) ให้กลายเป็นไบคาร์บอเนต แอนไอออน (HCO₃-) กับโปรตอน (H+) การแสดงออกของเอนไซม์ออกของเอนไซม์ CA โดยเฉพาะ human CA II (hCAII) มีความสัมพันธ์กับการก่อโรคต่าง ๆ ในมนุษย์ อาทิเช่น โรคต้อหิน เป็นต้น โดย hCAII ทำหน้าที่ในการผลิต HCO₃- ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของน้ำหล่อเลี้ยงลูกตา (aqueous humor) ในผู้ป่วยโรคต้อหินการระบายน้ำหล่อเลี้ยงตามีความบกพร่องทำให้ความดันภายในลูกตามีระดับที่สูงขึ้นและอาจนำไปสู่การสูญเสียการมองเห็น ดังนั้นการลดการผลิตน้ำหล่อเลี้ยงลูกตาจึงเป็นจุดมุ่งหมายของการรักษาโรค อย่างไรก็ตามในการค้นหายารักษาโรคต้อหินจำเป็นที่จะต้องมีระบบที่มีประสิทธิภาพในการค้นหา โครงงานนี้เป็นส่วนหนึ่งในโครงการวิจัยพัฒนาระบบคัดกรองฐานยีสต์สำหรับการค้นหาสารออกฤทธิ์ยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ hCAII หรือไม่ โดยมีจุดประสงค์เพื่อที่จะศึกษาว่าการติดอิพิโทป His ที่ตำแหน่งปลายด้าน N- ส่งผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์ hCAII ชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดประมาณ 800 คู่เบส ถูกเพิ่มจำนวนขึ้นโดยปฎิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสด้วยคู่ไพรเมอร์จำเพาะ โดยมีพลาสมิด pRS414 (GAL1.4_hCAII) เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ จากนั้นชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกไลเกชั่นกับพลาสมิดที่ใช้แสดงออกในยีสต์ (Yeast expression plasmid) เพื่อให้ได้รับพลาสมิด N-His-hCAII ที่แสดงออกภายใต้การควบคุมของ GAL1 โปรโมเตอร์ ซึ่งเป็นโปรโมเตอร์ชนิดที่ถูกชักนำให้มีการแสดงออกได้ พลาสมิดที่ได้ถูกนำไปทรานสฟอร์มเข้าสู่เซลล์ยีสต์ Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ที่ขาดยีน NCE103 (Δnce103) หรือยีนที่ประมวลรหัสเอนไซม์คาร์บอนิกแอนไฮเดรสในยีสต์ ผลการทดลองพบว่า hCAII ที่ถูกติดด้วยอิพิโทป His ที่ปลายด้าน N- สามารถทำหน้าที่ทดแทนหน้าที่ของ Nce103 ในยีสต์สายพันธุ์ AS01 (Δnce103) ได้ ซึ่งสายพันธุ์ยีสต์ที่ถูกสร้างขึ้นใหม่นี้อาจถูกใช้เพื่อค้นหายารักษาโรคต้อหินได้ต่อไป นอกจากนี้ยังสามารถทำเอนไซม์ hCAII ให้บริสุทธิ์ได้ง่าย เพื่อใช้ในการทดสอบการยับยั้งกิจกรรมของ hCAII ใน in vitro ได้ |
| Other Abstract: | Carbonic anhydrase (CAs) play an important role on reversible CO₂ hydration to HCO₃- and H+. The expression of CAs especially human CA II (hCAII) was found to associate with many human diseases including Glaucoma. The hCAII produces HCO3- which is the major component of aqueous humor. In glaucoma, aqueous humor can’t be drained out efficiently leading to the increase in intraocular pressure and resulting in visual loss. Therefore, the goal for glaucoma treatment is to reduce the aqueous humor production. However, the effective system for searching glaucoma drugs is important. This project, was in part of development of yeast-base assay for hCAII inhibitor screening system, aimed to see whether the addition of His-epitope tagging using at N-terminus of hCAII affect its activity or not. The hCAII DNA fragment was amplified by PCR a specific primer pair and pRS414 (GAL1.4_hCAII) as template. Then, the DNA fragment was cloned into a yeast expression plasmid to obtain a plasmid containing N-His-hCAII under a strong inducible GAL1 promoter. The obtained plasmid was transformed into a Saccharomyces cerevisiae strain lacking of NCE103, a gene encodes carbonic anhydrase-like enzyme (Δnce103). It was found that hCAII fused with His epitope tag at its N-terminus could functionally complement the Nce103 function in the Δnce103 mutant yeast. Thus, epitope tagging at the N-terminus of hCAII does not affect its carbonic anhydrase activity. Furthermore, the N-terminus His-epitope tag should facilitate purification step of hCAII from the yeast stain overexpressed N-His-hCAII. |
| Description: | โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2561 |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/65254 |
| Type: | Senior Project |
| Appears in Collections: | Sci - Senior Projects |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Sahakrit K_Se_2561.pdf | 1.92 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.