การสร้างอนุภาคเหมือนเดนโซไวรัสในกุ้งและการทดสอบประสิทธิภาพ

Abstract

โรคหัวเหลืองเป็นปัญหาที่สำคัญในอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงกุ้ง มีสาเหตุจากการติดไวรัสหัวเหลือง วิธีการหนึ่งในการป้องกันการติดไวรัสหัวเหลือง คือ การใช้อาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อยีนของไวรัสหัวเหลืองมากระตุ้นผ่านกระบวนการ RNA interference อย่างไรก็ตามวิธีการดังกล่าวยังมีข้อจำกัด เนื่องจากการฉีดอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองเข้าสู่กุ้งโดยตรง อาจถูกย่อยโดยเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสภายในกุ้ง ดังนั้นการใช้อนุภาคเหมือนไวรัสในการขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่อาจจะช่วยป้องกันการย่อยสลายของอาร์เอ็นเอสายคู่ภายในกุ้ง และช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการยับยั้งการติดไวรัสหัวเหลืองในกุ้งได้ โดยอาศัยคุณสมบัติของอนุภาคเหมือนไวรัสที่คล้ายคลึงกับไวรัสที่พบในธรรมชาติและสามารถเข้าจับแบบจำเพาะกับเซลล์เจ้าบ้าน ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์ในการสร้างอนุภาคเหมือนไวรัส PmDNV และ PstDNV เพื่อใช้เป็นตัวขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองและนำมาประยุกต์ใช้ในการป้องกันการติดไวรัสหัวเหลืองในกุ้ง ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการเพิ่มจำนวนยีนโปรตีนเปลือกหุ้มของไวรัส PmDNV และ PstDNV พบว่ามีขนาดประมาณ 1,600 และ 1,000 คู่เบสตามลำดับ มาเชื่อมเข้ากับ พลาสมิดที่ใช้สำหรับการแสดงออก pET28a(+) เพื่อแสดงออกใน E.coli Rosetta-gami ผลการทดลองพบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนเปลือกหุ้มของไวรัส PmDNV และ PstDNV สามารถชักนำให้เกิดการแสดงออกเมื่อชักนำด้วย 0.4 มิลลิโมลาร์ IPTG ที่อุณหภูมิ 30 °ซ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เมื่อทำการวิเคราะห์โปรตีนด้วย SDS-PAGE และ western blotting analysis พบรีคอมบิแนนท์โปรตีนขนาด 64 และ 37 กิโลดาลตันตามลำดับและโปรตีนดังกล่าวสามารถถูกจับด้วยแอนติบอดีที่จำเพาะต่อฮีสติดีนได้ จากนั้นนำไปทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ด้วย Nickel Affinity Chromatography พบว่าสามารถทำรีคอมบิแนนท์โปรตีนเปลือกหุ้มของไวรัสทั้งสองชนิดให้บริสุทธิ์ได้และเกิดการสร้างอนุภาคเหมือนไวรัสภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) แต่เนื่องจากข้อจำกัดในการทำโปรตีนให้เสียสภาพของรีคอมบิแนนท์โปรตีนเปลือกหุ้มของไวรัส PmDNV จึงได้คัดเลือกอนุภาคเหมือนไวรัส PstDNV มาใช้เป็นพาหะในการขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองต่อไป โดยนำรีคอมบิแนนท์แบคทีเรียมาสร้างเป็นเซลล์คอมพีเทนต์และทรานสฟอร์มพลาสมิดที่สร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลือง (YHV-Protease) ให้เกิดการแสดงออกภายในเซลล์แบคทีเรียเดียวกันผ่านการชักนำด้วย 0.4 มิลลิโมลาร์ IPTG ที่อุณหภูมิ 30 °ซ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง พบว่ามีการแสดงออกทั้งรีคอมบิแนนท์โปรตีนและอาร์เอ็นเอสายคู่ จากนั้นนำไปทำโปรตีนให้บริสุทธิ์และตรวจสอบการสร้างอนุภาคเหมือนไวรัส ซึ่งพบการรวมกลุ่มกันของอนุภาคเหมือนไวรัสและสามารถห่อหุ้มอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองได้ ต่อมานำอนุภาคเหมือนไวรัส PstDNV ที่ห่อหุ้มอาร์เอ็นเอสายคู่มาประยุกต์ใช้ในการยับยั้งการติดไวรัสหัวเหลืองในกุ้ง ผลการทดลองพบว่าการใช้อนุภาคเหมือนไวรัส PstDNV ในการขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองสามารถยับยั้งการติดไวรัสหัวเหลืองในกุ้งได้ดีกว่าการฉีดอาร์เอ็นเอสายคู่เข้าสู่กุ้งโดยตรง เมื่อควบคุมปริมาณอาร์เอ็นเอสายคู่ในปริมาณที่เท่ากัน นอกจากนี้เมื่อทำการทดสอบความสามารถในการยับยั้งการติดไวรัสหัวเหลืองในระยะยาว พบว่าอนุภาคเหมือนไวรัส PstDNV สามารถทำหน้าที่เป็นตัวขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อไวรัสหัวเหลืองป้องกันการย่อยสลายของอาร์เอ็นเอสายคู่จากเอนไซม์จากกุ้ง และป้องกันการยับยั้งการเพิ่มจำนวนของไวรัสหัวเหลืองในระยะยาวได้อีกด้วย