Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/77484
| Title: | การโคลน การแสดงออกในเซลล์เจ้าบ้านต่างชนิดและฤทธิ์ต้านจุลชีพของไทโอนินและสแนคินจากข้าว Oryza sativa L. subsp. japonica |
| Other Titles: | Cloning, heterologous expression and antimicrobial activity of thionin and snakin from rice Oryza sativa L. subsp. japonica |
| Authors: | กฤษณา บุญภา |
| Advisors: | ศุภอรรจ ศิริกันทรมาศ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Subjects: | ข้าว -- ความต้านทานโรคและศัตรูพืช การโคลนยีน Rice -- Disease and pest resistance Molecular cloning |
| Issue Date: | 2557 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | ผู้วิจัยคัดเลือกยีนไทโอนิน (THION15, Os06g0517700) และสแนคิน (GASR3, Os03g0760800) ซึ่งเป็นเปปไทด์ต้านจุลชีพจากข้าว (Orayza sativa L.) โดยการวิเคราะห์การแสดงออกร่วมของยีนและระดับการแสดงออกของยีน ในการศึกษาฤทธิ์ทางชีวภาพของ THION15 และ GASR3 ทำโดยโคลนยีน THION15 และ GASR3 เข้าสู่เวกเตอร์ pGEX-6p-3 เพื่อผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน Glutathione (GST)-THION15 และ GST-GASR3 ในแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ์ Rosetta gami (DE3) พบว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน GST-THION15 และ GST-GASR3 คือ ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เวลา 24 ชั่วโมง หลังจากที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย IPTG 0.1 มิลลิโมลาร์ จากนั้นตัด GST ออกด้วยเอนไซม์ PreScission protease ทำให้ได้รีคอมบิแนนท์โปรตีน THION15 และ GASR3 ที่บริสุทธิ์ 0.84 มิลลิกรัมต่อลิตร และ 0.65 มิลลิกรัมต่อลิตร ตามลำดับ เมื่อนำรีคอมบิแนนท์โปรตีนที่บริสุทธิ์ไปทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพในการต้านเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราก่อโรคในพืช ได้แก่ Xanthomanas oryzae pv. oryzae, Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum และ Helminthosporium oryzae จากการทดสอบในหลอดทดลองพบว่า ความเข้มข้นต่ำสุดของรีคอมบิแนนท์ THION15 ที่ใช้ในการทดลองครั้งนี้มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใยรา F. oxysporum และ H. oryzae คือ 0.58 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่รีคอมบิแนนท์ GASR3 ยับยั้งได้ที่ 1.04 ไมโครโมลาร์ และยังพบว่า รีคอมบิแนนท์ THION15 มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย X. oryzae pv. oryzae และ E. carotovora โดยมีความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ (MIC) เท่ากับ 8.77 และ 1.09 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ ฤทธิ์ทางชีวภาพนี้สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการควบคุมเชื้อก่อโรคในข้าวได้ นอกจากนี้ยังพบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์และการแสดงออกของยีน THION15 และ GASR3 ที่พบในข้าวสายพันธุ์ไทย (Oryza sativa L. 'KDML 105') มีรูปแบบเหมือนกับที่พบในข้าวสายพันธุ์ญี่ปุ่น (O. sativa L. 'koshihikari') |
| Other Abstract: | The antimicrobial peptides (AMP), thionin (THION) 15 (Os06g0517700) and snakin (GASR) 3 (Os03g0760800), from rice (Oryza sativa L.) were chosen based on the gene co-expression network and in silico gene expression level analyses. To investigate their antimicrobial activities, THION15 and GASR3 were cloned into pGEX-6P-3 expression vector to produce GST-THION15 and GST-GASR3 fusion protein in Escherichia coli strain Rosetta-gami (DE3). The optimal condition for the production of GST-THION15 and GST-GASR3 recombinant fusion protein were at 37°C for 24 hours with 0.1 mM IPTG induction. GST proteins were cleaved away from the fusion proteins with PreScission protease, yielding the purified recombinant THION15 and GASR3 at 0.84 mg/L and 0.65 mg/L, respectively. The purified recombinant proteins were then tested for the inhibitory activities against plant pathogenic bacteria and fungi such as Xanthomanas oryzae pv. oryzae, Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum and Helminthosporium oryzae. In vitro assays revealed that the minimum concentration of recombinant THION15 used in this study that inhibit the hyphal growths of F. oxysporum and H. oryzae were at 0.58 µM, while that of recombinant GASR3 were at 1.04 µM. The recombinant THION15 was able to inhibit the growths of bacteria X. oryzae pv. oryzae and E. carotovora with MIC values of 8.77 and 1.09 µM, respectively. These activities suggest a possible application of these recombinant proteins for rice disease control. In addition, it was found that the nucleotide sequences and gene expression patterns of THION15 and GASR3 in Thai rice (Oryza sativa L. 'KDML 105') are the same as that of Japanese rice (O. sativa L. 'koshihikari'). |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2557 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | เทคโนโลยีชีวภาพ |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/77484 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 5472254723.pdf | 3.64 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.