Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80627
| Title: | การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนหนามของ SARS-CoV-2 เพื่อการพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย COVID-19 |
| Other Titles: | Expression and purification of spike protein of SARS-CoV-2 for diagnostic test development |
| Authors: | ศุภเสกข์ คาดการณ์ไกล |
| Advisors: | ธนาภัทร ปาลกะ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Subjects: | โควิด-19 (โรค) -- การวินิจฉัย ชุดตรวจวินิจฉัยโรคสำเร็จรูป โปรตีน -- การวิเคราะห์ COVID-19 (Disease) -- Diagnosis Diagnostic reagents and test kits Proteins -- Analysis |
| Issue Date: | 2563 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | โรคโควิด-19 เป็นโรคติดต่อทางระบบทางเดินหายใจที่เกิดจากเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์กลุ่มโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS-CoV-2 : Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) ไวรัส SARS-CoV- 2 ติดเชื้อบริเวณทางเดินหายใจส่วนล่างของมนุษย์โดยอาศัยการจับกันของโปรตีนหนาม (Spike) ที่ ประกอบด้วยหน่วยย่อย S1 และ S2 โดย S1 โครงสร้างที่สำคัญที่มี RBD (Receptor binding domain) ซึ่งมีความจำเพาะในการจับกับ Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor ของมนุษย์เพื่อเข้าสู่เซลล์สามารถติดต่อผ่านการสัมผัสกับผู้ติดเชื้อ ผ่านละอองเสมหะจากการไอ จาม น้ำมูก น้ำลาย ทำให้มีการแพร่ระบาดเป็นวงกว้างจนองค์การอนามัยโลกประกาศให้เป็นการระบาดระดับ “Pandemic” เนื่องด้วย COVID-19 เป็นโรคอุบัติใหม่การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย พัฒนาวัคซีนมีความจำเป็นในการควบคุมการระบาด แต่การจะใช้ไวรัสเชื้อเป็น (live virus) ต้องอาศัยห้องปฏิบัติการที่มีระบบความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 (biosafety level III) ดังนั้น การใช้โปรตีนโครงสร้างของไวรัส SARS-CoV-2 จะเป็นหนึ่งในทางเลือกทำให้การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยและวัคซีนสามารถดำเนินไปได้สะดวกรวดเร็วยิ่งขึ้น ในงานวิจัยนี้จึงศึกษาการแสดงออกของโปรตีนหนามโดยอาศัยพลาสมิด 4 ชนิด ได้แก่ pCI neo stabilized spike, pCI neo RBD, pCMV S1, pCMV RBD ซึ่งถูกแปลรหัสเป็นโปรตีน 2 ชนิด คือ Spike และ RBD มีขนาดประมาณ 200 และ 27 kDa (kilodalton) ตามลำดับ โดยนำพลาสมิดเข้าสู่ cell line 2 ชนิด ได้แก่ CHO-K1และ HEK293 ซึ่งนำเข้าเซลล์แบบชั่วคราวโดยใช้ Fugene HD เพื่อทดสอบความสามารถในการแสดงออกโปรตีนแต่ละตัว พบว่ามีเพียง HEK293 ที่สามารถแสดงออกโปรตีนจากพลาสมิด pCI neo stabilized spike และ pCI neo RBD จึงทำการคัดเลือกเซลล์ HEK293 ที่มีพลาสมิดโดยใช้ยา G418 (Geneticin) จากนั้นนำโปรตีนไปทำให้บริสุทธิ์ (purification) โดยวิธี affinity chromatography และตรวจสอบด้วย SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) และ Western blot ซึ่งใช้ α His tag rabbit mAb เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิ ซึ่งการศึกษาเพิ่มเติมด้วยการทำ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) โดยทำการทดลองกับเลือดผู้ป่วยที่หายจากโรคจะสามารถตรวจสอบความสามารถในการจับกับ antibody และนำไปสู่การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย COVID-19 ต่อไป |
| Other Abstract: | COVID-19 is a severe acute respiratory syndrome caused by coronavirus (SARS-CoV-2), COVID-19 can be spread through contact with infected people, droplet from coughing, sneezing, mucus, saliva causing an epidermic occurring worldwide call “Pandemic” because this virus infects host cells using specific interaction between Receptor binding domain (RBD) within the S1 domain of Coronavirus Spike protein and Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor on host cell. Due to COVID-19 is a serious emerging disease, the development of diagnostic kits and vaccine is essential to control the outbreak, viral Neutralizing test use live virus and it needs to be performed in biosafety level III. Therefore, using recombinant structural protein of SARS-CoV-2 will offer alternative testing method. In this research, the expression of S protein by using four plasmids was studied. Those plasmids are pCI neo stabilized spike, pCI neo RBD, pCMV S1, pCMV RBD, the Spike and RBD protein have putative molecular weight are 200 and 27 kilodalton respectively. We transfect all into CHO-K1, HEK293 by using Fugene HD, Calcium-phosphate in transient transfection method and found that only HEK293 could express those protein from those plasmids pCI neo vector. In addition, we select transfected HEK293 by using G418 (Geneticin) and then harvest culture supernatant for purification by using affinity chromatography. The purified protein was confirm by SDS-PAGE and Western blot that using α His tag rabbit pAb as primary antibody. Further study using serum of COVID-19 convalescent patient or vaccinated people with ELISA can test binding activity of our recombinant protein lead to the diagnostic test development. |
| Description: | โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2563 |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80627 |
| Type: | Senior Project |
| Appears in Collections: | Sci - Senior Projects |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 63-SP-MICRO-035 - Supasek Ka_2563.pdf | 28.74 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.