Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80660
| Title: | การทดสอบความแม่นยำของการตรวจวัดดัชนีการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต (โคซี่) เพื่อการวินิจฉัยโรคนิ่วในปัสสาวะ และการพัฒนานวัตกรรมวิธีการตรวจวัดปริมาณออกซาเลตในปัสสาวะโดยอาศัยอนุภาคนาโนควอนตัมดอท |
| Other Titles: | Test accuracy of urinary calcium oxalate crystallization index (COCI) for diagnosis of urolithiasis, and development of an innovative quantum dot nanoparticlebased method for determination of urinary oxalate |
| Authors: | ชาญชัย บุญหล้า |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะแพทยศาสตร์ |
| Subjects: | นิ่ว นิ่วทางเดินปัสสาวะ แคลเซียมออกซาเลท |
| Issue Date: | 2561 |
| Publisher: | คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | โรคนิ่วปัสสาวะเป็นภาวะที่มีก้อนนิ่วในระบบทางเดินปัสสาวะ ซึ่งเป็นปัญหาสุขภาพมายาวนานมาก ทั่วโลก และยิ่งมากขึ้นในประเทศเขตร้อน รวมทั้งประเทศไทย นิ่วปัสสาวะส่วนใหญ่เกิดขึ้นในไต เรียกว่า นิ่วไต ซึ่งปัจจุบันถือว่านิ่วไตเป็นหนึ่งในปัจจัยเสี่ยงสำคัญของโรคไตวายเรื้อรัง โดยทั่วไปนิ่วมีหลายชนิดแต่ที่พบมาก ที่สุดคือ นิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลต เกิดจากการอิ่มตัวยวดยิ่งของปัสสาวะแล้วทำให้ตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต ดังนั้น การวัดว่าปัสสาวะความสามารถในการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลตได้มากน้อยเพียงใด จะสามารถ ประเมินความเสี่ยงต่อการเกิดนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลตในปัสสาวะได้ คณะวิจัยได้พัฒนาเทคนิคการตรวจวัด ดัชนีการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต (โคซี่) ขึ้นมาในปี ค.ศ. 2014 สำหรับคัดกรองโรคนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลตในปัสสาวะ ซึ่งได้ผลดี แต่กระบวนการตรวจวัดโคซี่ยังใช้เวลานาน ใช้เวลาตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต 60 นาที การศึกษานี้จึงปรับวิธีการทำใหม่โดยลดเวลาตกผลึกลงเป็น 10 นาที จากนั้นวัดค่าโคซี่ด้วยวิธีใหม่นี้ใน ตัวอย่างปัสสาวะ 24 ชั่วโมง (n=302) จากกลุ่มผู้ป่วยนิ่วจำนวน 176 ราย และกลุ่มที่ไม่เป็นนิ่วจำนวน 129 ราย ค่าโคซี่ในปัสสาวะของกลุ่มผู้ป่วยนิ่วสูงกว่ากลุ่มไม่เป็นนิ่วอย่างมีนัยสำคัญ ผลการวิเคราะห์ ROC เพื่อ จำแนกคนที่เป็นนิ่วออกจากคนที่ไม่เป็นนิ่ว พบว่าวิธีโคซี่มีค่าพื้นที่ได้กราฟเท่ากับ 0.7651 (95% CI: 0.7124– 0.8178) สำหรับจำแนกคนเป็นนิ่วทั้งหมด และเท่ากับ 0.8839 (95% CI: 0.8115–0.9564) สำหรับจำแนก เฉพาะคนที่เป็นนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลต ผลการศึกษานี้ชี้ว่าวิธีโคซี่ที่พัฒนาขึ้นนี้มีความแม่นยำในการ วินิจฉัยโรคนิ่วปัสสาวะในระดับปานกลาง (moderately accurate: มีค่าพื้นที่ได้กราฟอยู่ระหว่าง 0.7-0.9) เมื่อกำหนดค่าปกติ (cutoff) ที่ 460 COM eqv. mg/day วิธีโคซี่นี้จะให้ค่าการวินิจฉัย sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value และ accuracy เท่ากับ 84%, 81%, 61%, 94% และ 82% ตามลำดับ ซึ่งเพียงพอที่จะนำมาใช้ในคลินิกจริงสำหรับคัดกรองได้ อีกปัญหาหนึ่งของ วิธีการทำโคซี่คือต้องใช้การปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกตะกอนผลึกโคซี่ออกมาซึ่งการปั่นเหวี่ยงทำให้ต้องใช้เวลาเพิ่มขึ้น คณะผู้วิจัยจึงพัฒนาวิธีใหม่เพิ่มเติม เรียกว่า magnetic-assisted COCI (mCOCI) โดยมีแนวคิดว่าจะฝัง magnetic nanoparticles เข้าไปในผลึกโคซี่ แล้วแยกผลึกออกมาโดยใช้แรงแม่เหล็กแทนการใช้แรงปั่น เหวี่ยง แต่ผลการทดลองไม่เป็นไปตามที่คาดไว้ ถึงแม้ magnetic nanoparticles ถูกฝังเข้าไปในผลึกได้ แต่ การแยกผลึกด้วยแรงแม่เหล็กไม่มีประสิทธิภาพเท่าที่ควร เหตุผลหลักมาจากความแรงของแม่เหล็กในผลึกต่ำ มากจนไม่สามารถใช้แม่เหล็กดูดได้ดี นอกจากนี้คณะผู้วิจัยได้พยายามที่จะปรับปรุงวิธีโคซี่ให้ถูกลงและใช้งาน ง่ายขึ้น โดย เปลี่ยนจากการวัดปริมาณผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลตจากการวัดด้วยค่าการดูดกลืนแสงช่วงคลื่น UV ที่ 215 nm มาเป็นช่วงคลื่น visible ที่ 470 nm วิธีที่พัฒนาขึ้นเพิ่มเติมจากโคซี่เดิมนี้ เรียกว่า chromogenic COCI (cCOCI) มีหลักการคือฝังสารสี Coomassie brilliant blue (CBB, R-250) เข้าไปใน ผลึกโคซี่ ทำให้ผลึกใหญ่ขึ้น ตกตะกอนได้ง่ายขึ้น และผลึกเปลี่ยนจากไม่มีสีเป็นสีฟ้า ผลึกสีฟ้าที่ได้จะล้างด้วย สารละลายอะซิติกแล้วละลายด้วย 2 N HCl จะได้เป็นสารละลายสีม่วงแดง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 470 nm ผลการทดลองพบว่าค่า cCOCI ให้ผลสอดคล้องกับค่า COCI ซึ่งผลการศึกษาทำให้เชื่อว่า cCOCI น่าจะสามารถประยุกต์ใช้ในคลินิกได้ดีกว่าและถูกกว่า COCI เดิม อีกหนึ่งวัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการพัฒนาวิธีใหม่สำหรับตรวจวัดปริมาณออกซาเลตในปัสสาวะ และในตัวอย่างอาหาร คณะผู้วิจัยได้พัฒนาขึ้นมา 2 วิธีที่มีหลักการต่างกัน คือ วิธีที่หนึ่งอาศัย quantum dot (QD) nanoparticles และลิแกนด์ที่จับจำเพาะกับออกซาเลต (oxalate-binding ligands) เรียกวิธีนี้ว่า QDbased oxalate test ซึ่งปัจจุบันสามารถสังเคราะห์ oxalate-binding ligands ได้แล้วและอยู่ระหว่างการ เชื่อมต่อกับ QD nanoparticles ส่วนวิธีที่สองวัดปริมาณออกซาเลตโดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์ oxalate oxidase (OxO) และการสร้าง protein nanoparticles เป้าหมายที่พัฒนาวิธี enzymatic oxalate test นี้ขึ้นมา คือ เพื่อใช้เป็น point-of-care testing (POCT) ปัจจุบันคณะผู้วิจัยสามารถโคลน recombinant OxO (ยีนจากข้าวบาร์เลย์) ในยีส (Pichia pastoris) ได้แล้ว อยู่ในขั้นตอนการเพิ่มปริมาณให้ มากขึ้นเพื่อใช้ผลิต OxO-containing protein nanoparticles ในระหว่างนี้คณะผู้วิจัยได้พัฒนา POCT สำหรับการตรวจวัดกลูโคสขึ้นด้วย แนวคิดคือต้องการให้ 1 POCT test สามารถตรวจวัดได้พร้อมกันทั้งออก ซาเลตและกลูโคส ซึ่งจะมีประโยชน์มากสำหรับผู้ป่วยนิ่วให้สามารถรู้ได้ว่าอาหารที่กำลังจะรับประทานนั้นมี ปริมาณออกซาเลตและกลูโคสมากน้อยเพียงใด ทำให้สามารถเลี่ยงการรับประทานอาหารที่มีออกซาเลตและ น้ำตาลสูงได้ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อการป้องกันการเกิดนิ่วซ้ำในอนาคต และยังเป็นประโยชน์ต่อคนปกติทั่วไป ที่ต้องการเลี่ยงอาหารที่มีออกซาเลตและน้ำตาลสูงด้วย |
| Other Abstract: | Urinary stone disease or urolithiasis, a condition with presence of mineral masses in the urinary tract, is a long-standing urologic problem worldwide, and it is more pronounced in the tropics, especially Thailand. Most of urinary stones are formed in kidneys, so-called kidney stone that increases risk of chronic renal failure. The most common type of stones is calcium oxalate (CaOx), and formation of this stone is driven by urinary CaOx supersaturation and crystallization. Therefore, measurement of urine capacity to crystallize CaOx is reasonable to estimate the risk of CaOx stone formation. We had developed a new method called calcium oxalate crystallization index (COCI) to be used for screening CaOx urolithiasis. The original procedure od COCI test published in 2014 was time-consuming, as it set an incubation time for CaOx crystallization at 60 min. In this study, the incubation time was reduced to 10 min, and COCI values based on the new procedure were measured in 24-h urine samples (n=302) from stone-forming subjects (SFS, n=173) and non-stone forming subjects (NSFS, n=129). Urinary COCI values in SFS were significantly greater than that in NSFS. ROC analysis to separate SFS from NSFS revealed an area under curve (AUC) of COCI test of 0.7651 (95% CI: 0.7124–0.8178) and 0.8839 (95% CI: 0.8115–0.9564) for all stone cases and only Ca stone cases, respectively. This indicated that the COCI test had a moderate diagnostic power (AUC: 0.7-0.9), especially for Ca stone urolithiasis. At cutoff of 460 COM eqv. mg/day, it gave sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy of 84%, 81%, 61%, 94% and 82%, respectively. The other issue of COCI procedure was that it required centrifugation to separate the crystals and it takes time. We, therefore, developed the new form of COCI called magnetic-assisted COCI (mCOCI). The idea of mCOCI is to embed magnetic nanoparticles into the COCI crystals in order to separate the crystals by magnet instead of centrifugation. Unfortunately, the mCOCI did not work. We could embed the magnetic nanoparticles into the crystals, but magnetic separation was relatively ineffective, mainly due to the low magnetic strength of the magnetic nanoparticles-embedded COCI crystals. The other thing that we tried to improve the COCI measurement is to change the way to quantify amount of CaOx crystals from UV absorption at 215 nm to visible wavelength at 470 nm, as UV spectrophotometer is rather expensive and not practical for the routine laboratory measurement. An alternative form of COCI was developed and designated chromogenic COCI (cCOCI). Coomassie brilliant blue (CBB, R-250) was embedded into the COCI crystals, and the crystals turned blue. The stained crystals were washed with acetic solution and re-dissolved in 2 N HCl for measuring absorbance at 470 nm. The data of cCOCI were corresponded well with COCI data, suggested that that cCOCI test could be clinically useful. The other purpose of the present study was to develop novel tests for measuring oxalate in urine and food samples. Two methods with different detection principles have been developed. One method was developed based on quantum dot (QD) nanoparticles and oxalate-binding ligands, called QD-based oxalate test. The other was based on enzymatic reaction of oxalate oxidase (OxO) and protein nanoparticles, and we aimed to use this enzymatic oxalate test as point-of-care testing (POCT). We successfully synthesized oxalate-binding ligands and be ready for conjugating with QD nanoparticles. For recombinant OxO, we successfully cloned the Barley OxO in yeasts (Pichia pastoris), and be ready for upscaling to get sufficient amount of OxO enzyme for fabrication of OxO-containing protein nanoparticles. POCT for detection of glucose was also developed. The idea was that to have a dual detection of oxalate and glucose in one test. It will be useful for the stone patients to know levels of oxalate and glucose in ready-to-eat food, in order to avoid consumption of food containing high oxalate and sugar. Also, it will be beneficial for general healthy people who want to avoid intake of oxalate and sugar rich diets. |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80660 |
| Type: | Technical Report |
| Appears in Collections: | Med - Research Reports |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Med_Chanchai Boon_2561.pdf | รายงานการวิจัยฉบับเต็ม (Fulltext) | 1.08 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.