การประยุกต์วิธีการวินิจฉัยมาลาเรียจากตัวอย่างปัสสาวะและน้ำลายเพื่อประเมินสภาวะของโรคมาลาเรียในเชิงระบาดวิทยา

จตุรงค์ พุทธพรทิพย์; สมชาย จงวุฒิเวศย์; สุนีย์ สีธรรมใจ; วรรณภา สุวรรณเกิด

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/81272

Title:	การประยุกต์วิธีการวินิจฉัยมาลาเรียจากตัวอย่างปัสสาวะและน้ำลายเพื่อประเมินสภาวะของโรคมาลาเรียในเชิงระบาดวิทยา
Other Titles:	Application of noninvasive malaria diagnosis using urine and saliva samples for epidemiological assessment
Authors:	จตุรงค์ พุทธพรทิพย์ สมชาย จงวุฒิเวศย์ สุนีย์ สีธรรมใจ วรรณภา สุวรรณเกิด
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะแพทยศาสตร์
Subjects:	มาลาเรีย มาลาเรีย -- การวินิจฉัย
Issue Date:	2556
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	การจำแนกชนิดของเชื้อมาลาเรียได้อย่างถูกต้องและการตรวจหาเชื้อมาลาเรียที่มีความไวสูงนับเป็นพื้นฐานอันสำคัญในการรักษาและควบคุมโรคมาลาเรียซึ่งเป็นโรคติดเชื้อที่สำคัญที่สุดชนิดหนึ่งของมนุษยชาติ โดยทั่วไปการวินิจฉัยโรคมาลาเรียอาศัยการตรวจหาเชื้อจากฟิล์มโลหิตที่ผ่านการย้อมสียิมซาอันทำให้การรักษาโรคเป็นไปได้อย่างมีประสิทธิภาพในเวชปฏิบัติทั่วไป อย่างไรก็ตามมีผู้ติดเชื้อมาลาเรียหลายรายที่มีปริมาณเชื้อในกระแสเลือดต่ำกว่าระดับที่สามารถตรวจพบได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ดังนั้นจึงมีผู้ติดเชื้อจำนวนมากที่ยังประสบปัญหาความเจ็บป่วยและอาจเสียชีวิตได้รวมทั้งยังเป็นการสูญเสียทางเศรษฐกิจร่วมด้วย นอกจากนี้การจำแนกชนิดของเชื้อมาลาเรียในฟิล์มโลหิตอาจพบลักษณะเชื้อที่ไม่จำเพาะชัดเจนทำให้การวินิจฉัยดังกล่าวขาดความแม่นยำนอกเหนือไปจากปัจจัยในด้านความแตกต่างในทักษะและความสามารถของจุลทรรศนากร ในภายหลังจากการพัฒนาการตรวจหาและจำแนกชนิดของเชื้อมาลาเรียโดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (PCR) ทำให้สามารถวินิจฉัยมาลาเรียได้โดยปราศจากอุปสรรคที่พบในการตรวจหาเชื้อภายใต้กล้องจุลทรรศน์ การประยุกต์ใช้วิธี PCR ในการตรวจวินิจฉัยมาลาเรียนั้นยังเป็นการสร้างโอกาสให้มีการใช้ตัวอย่างน้ำลายและปัสสาวะในการเป็นแหล่งดีเอ็นเอทางเลือกสำหรับการตรวจดังกล่าวแม้ว่าความไวในการวินิจฉัยยังด้อยกว่าผลที่ได้จากการตรวจหาเชื้อภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ในการศึกษานี้คณะผู้วิจัยได้พัฒนาวิธี PCR เพื่อตรวจและจำแนกมาลาเรียทั้ง 5 ชนิดที่ก่อโรคในคนโดยอาศัยยืนเป้าหมายคือไซโตโครมอ๊อกซิเดสหน่วยย่อยที่ 1 (PCR-COXI) ไซโตโครมอ๊อกซิเดสหน่วยย่อยที่ 3 (PCR-COXIII และ PCR-COXIII-3) และไซโตโครมบี (PCR-Cytb-New) ในจีโนมของไมโตคอนเดรีย จากการวิเคราะห์เชิงเปรียบเทียบพบว่า PCR-Cytb-New มีประสิทธิภาพในการวินิจฉัยได้ทัดเทียมกับ PCR-Cytb ที่คณะผู้วิจัยได้พัฒนามาก่อนหน้านี้ เพื่อเป็นการพัฒนาความไวและประเมินประสิทธิภาพของการใช้ตัวอย่างน้ำลายและปัสสาวะในการวินิจฉัยโรคมาลาเรีย คณะผู้วิจัยได้รวบรวมผู้ป่วยที่มีไข้ที่มารับการตรวจวินิจฉัยโรคมาลาเรีย ณ มาลาเรียคลินิกในพื้นที่จังหวัดตาก เชียงใหม่ เชียงราย แม่ฮ่องสอนและจันทบุรีในการศึกษาครั้งนี้ ผลการตรวจวินิจฉัยโดยกล้องจุลทรรศน์พบผู้ที่ติดเชื้อพลาสโมเดียมฟัลซิปารั่ม 110 ราย ผู้ที่ติดเชื้อพลาสโมเดียมไวแวกซ์ 128 ราย และมีผู้ติดเชื้อทั้งสองชนิดร่วมกัน 3 ราย เมื่อทำการเพิ่มปริมาณตัวอย่างเลือด น้ำลายและปัสสาวะเป็น 200 ไมโครลิตรในการเตรียมดีเอ็นเอสำหรับการตรวจโดยวิธี PCR-Cytb พบว่าตัวอย่างเลือดให้ผลการตรวจจำแนกชนิดของมาลาเรียอย่างชัดเจนและสามารถตรวจ พบมาลาเรียทั้ง 5 ชนิดในประชากรที่ศึกษาและพบผู้ติดเชื้อมาลาเรียต่างชนิดร่วมกันเพิ่มขึ้นเป็น 11 ราย ในขณะที่ผลการตรวจโดยใช้ตัวอย่างน้ำลายให้ความไวสูงกว่าผลการตรวจหาเชื้อพลาสโมเดียมฟัลซิปารั่ม และพลาสโมเดียมไวแวกซ์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เล็กน้อย แม้ว่าผลการตรวจโดยใช้ตัวอย่างปัสสาวะจะมีความไวต่ำกว่าผลการตรวจหาเชื้อภายใต้กล้องจุลทรรศน์แต่ความแตกต่างดังกล่าวมีเพียงเล็กน้อยซึ่งไม่น่าจะเป็นอุปสรรคต่อการใช้ตัวอย่างปัสสาวะในการเป็นแหล่งดีเอ็นเอทางเลือกสำหรับการตรวจวินิจฉัยโดยวิธีการทางอณูชีววิทยา นอกจากนี้ยังพบว่าตัวอย่างน้ำลายและปัสสาวะยังสามารถใช้ตรวจความหลากหลายในรูปแบบอัลลีลของยีนสำหรับโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 2 ของเชื้อพลาสโมเดียมฟัลซิปารั่มและยีนสำหรับโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 1 ของเชื้อพลาสโมเดียมไวแวกซ์ ซึ่งพบว่าอัลลีลในกลุ่ม 3D7 ของยีนสำหรับโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 2 อัลลีล Sal-1/Belem type b ของยีนสำหรับโปรตีนบนผิวเมอร์โรซอยต์ชนิดที่ 1 มีอุบัติการณ์สูงสุดในประชากรที่ศึกษา แม้ว่าการตรวจสอบอัลลีลเหล่านี้จากตัวอย่างปัสสาวะจะให้ผลด้อยกว่าการตรวจจากตัวอย่างเลือดประมาณร้อยละ 30 และร้อยละ 60 ตามลำดับแต่พบว่าผลการตรวจสอบการกระจายของอัลลีลในประชากรที่ศึกษามีความสอดคล้องกันชัดเจนไม่ว่าจะใช้ตัวอย่างใดก็ตาม ในการติดตามผู้ติดเชื้อพลาสโมเดียมฟัลซิปารั่มจำนวน 17 รายและพลาสโมเดียมไวแวกซ์จำนวน 18 รายพบว่าไม่สามารถตรวจพบดีเอ็นเอของมาลาเรียได้ในตัวอย่างเลือด น้ำลายและปัสสาวะในวันที่ 7 14 21 และ 28 ยกเว้นมีผู้ป่วยที่ติดเชื้อพลาสโมเดียมฟัลซิปารั่ม 2 รายที่ยังคงให้ผลบวกในการตรวจโดยใช้ตัวอย่างเลือดในวันที่ 7 ทั้งนี้ผลดังกล่าวน่าจะเกิดจากการที่ดีเอ็นเอของเชื้อมาลาเรียถูกกำจัดออกจากร่างกายได้ช้ากว่าปกติในผู้ติดเชื้อเหล่านี้เนื่องจากตัวอย่างในภายหลังวันที่ 7 ล้วนให้ผลการตรวจเป็นลบทั้งที่ผู้ติดเชื้อเหล่านี้ไม่ได้รับยาต้านมาลาเรียเพิ่มเติมอีกเลย โดยสรุปจากการศึกษานี้พบว่าการเพิ่มปริมาตรของตัวอย่างสิ่งส่งตรวจทำให้สามารถใช้ตัวอย่างน้ำลายและปัสสาวะเพื่อเป็นแหล่งดีเอ็นเอทางเลือกสำหรับการตรวจโดยวิธี PCR ที่มีความไวสูงสำหรับการวินิจฉัยและจำแนกมาลาเรียทั้ง 5 ชนิดที่ก่อโรคในคนรวมทั้งสามารถตรวจสอบการกระจายของรูปแบบอัลลีลของยีนที่สร้างโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของวัคซีนป้องกันโรคมาลาเรีย อย่างไรก็ตามการประเมินวิธีการที่พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้โดยใช้ตัวอย่างจำนวนมากขึ้นนับเป็นสิ่งจำเป็นก่อนการนำไปประยุกต์ในเวชปฏิบัติซึ่งจะนำมาซึ่งวิธีการวินิจฉัยโรคมาลาเรียแนวใหม่ที่ไม่ต้องทำการเจาะเลือดจากผู้ป่วยอีกต่อไป
Other Abstract:	Accurate species identification and sensitive detection of malaria parasites are the foundation of treatment and control of malaria, one of the most important infectious diseases of mankind. Microscopy detection with giemsa-stained blood films has been widely deployed for malaria diagnosis, enabling effective management in general clinical practice. However, a number of malaria-infected individuals may harbor low number of parasites in their circulation that could escape conventional microscopy detection threshold; thereby, a considerable number of malaria-related morbidity and mortality as well economic loss could ensue. Furthermore, morphological detection of malaria parasites in blood smears may not unambiguously and accurately identify malaria species besides a considerable variation in competency of microscopists. The advent of polymerase chain reaction (PCR)-based detection and speciation of malaria parasites in blood samples has circumvented limitation of microscopy detection. Importantly, application of PCR -based method has provided a possibility of using saliva and urine samples as alternative DNA sources for malaria diagnosis although the sensitivity remains inferior to that of conventional microscopy detection. Herein, we have devised PCR -based method for detection and identification of all five human malaria species targeting genes encoding cytochrome oxidase subunit I (PCR-COXI), cytochrome oxidase subunit III (PCR-COXIII and PCR-COXIII3') and cytochrome b (PCR-Cytb-New) of the mitochondrial genome. Comparative analysis has revealed that PCR-Cytb-New confers comparable diagnostic performance with PCR-Cytb previously developed by us. To assess and improve diagnostic sensitivity of using saliva and urine samples for malaria diagnsis, 502 febrile individuals who attended malaria clinics in Tak, Chiangmai, Chiangrai, Mae Hong Sorn and Chantaburi Provinces were recruited in this study. Of these, microscopy could detect 110 Plasmodium falciparum, 128 P. vivax and 3 co-infections of both species. By increasing volume of blood, saliva and urine samples to 200 III for DNA template preparation, PCR-Cytb from blood samples could clearly identify all five malaria species and 11 cases with mixed species infections whereas results from saliva samples yielded slightly more sensitive detection ofP.falciparum and P. vivax than microscopy. Although PCR results from urine samples were less sensitive than that from microscopy, the difference seems to be trivial that may not preclude using urine as an alternative DNA source for molecular diagnosis. Meanwhile, saliva and urine samples could be used to detect allelic diversity in the merozoite surface protein 2 locus of P.falciparum (PfMsp2) and the merozoite surface protein 1 locus of P. vivax (PvMsp1) in which 3D7 family of the former and Sal-1/Belem type b of the latter predominate in this study population. Despite the fact that allele typing of these loci using saliva and urine samples offered approximately 30% and 65%, respectively, less sensitive than using blood samples, alleleic distribution of these loci in the study population was remarkbly concordant regardless of the sources of samples used. Follow-up study of 17 P falciparum-infected patients and 18 P. vivax-infected patients has shown that malarial DNA could not be detected in blood, saliva and urine samples of these patients on day 7, 14,21 and 28 except two positive PCR results from blood samples on day 7 obtained from patients infected with P falciparum. It is likely that delayed clearance of malarial DNA occurred in these patients because subsequent negative PCR results were observed without additional antimalarial drug administration. Taken together, using a sensitive PCR detection and increasing volume of clinical samples enables saliva and urine samples be deployed as alternative DNA sources for diagnosing all five human malaria species as well as for determination of allelic distribution of malaria vaccine candidate genes. Further assessment of the methods described herein by recruiting larger scale of sample size will be required prior to general clinical implementation that will lead to novel non-invasive malaria diagnosis.
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/81272
Type:	Technical Report
Appears in Collections:	Med - Research Reports

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
Jaturong P_Res_2556.pdf	รายงานการวิจัยฉบับเต็ม (Fulltext)	8.79 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record