การพัฒนาชุดตรวจที่ง่ายต่อการใช้งานสำหรับวัณโรคในช้างโดยอินเตอร์เฟียรอนแกมมารีลีส

จิตสุดา พงษ์มา

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/84393

Title:	การพัฒนาชุดตรวจที่ง่ายต่อการใช้งานสำหรับวัณโรคในช้างโดยอินเตอร์เฟียรอนแกมมารีลีส
Other Titles:	Development of user friendly diagnostic kit for elephant tuberculosis by interferon gamma release
Authors:	จิตสุดา พงษ์มา
Advisors:	ธนาภัทร ปาลกะ
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Issue Date:	2563
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	วัณโรค เป็นโรคติดต่อจากสัตว์สู่คนหรือจากคนสู่สัตว์ที่เป็นปัญหาด้านสาธารณสุขที่สำคัญระดับโลก รวมถึงในประเทศไทย เนื่องจากเชื้อ Mycobacterium tuberculosis (M. tb) complex (MTBC) ซึ่งเป็นเชื้อสาเหตุของวัณโรค สามารถพบการติดเชื้อได้ในสัตว์หลายกลุ่ม ทั้งสัตว์เท้ากีบ สัตว์ตระกูลลิง สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมรวมถึงช้าง การวินิจฉัยวัณโรคในช้างทำได้ยาก เนื่องจากช้างเป็นสัตว์ที่มีขนาดใหญ่ จึงไม่สามารถวินิจฉัยได้ด้วยวิธีเดียวกับมนุษย์ เช่น การเอกซเรย์ปอด และการทดสอบทางผิวหนัง นอกจากนี้ วิธีมาตรฐานโดยการเพาะเลี้ยงเชื้อจากน้ำล้างงวงช้างมีความไวต่ำ ใช้เวลานาน และตรวจได้เฉพาะระยะที่แสดงอาการเท่านั้น ดังนั้น การตรวจวินิจฉัยที่แม่นยำ ครอบคลุมทุกระยะการติดเชื้อ M. tb จึงเป็นสิ่งจำเป็น นำมาสู่การประยุกต์ใช้เทคนิค Interferon gamma release assay (IGRA) สำหรับเป็นวิธีทางเลือกในการวินิจฉัยวัณโรค ซึ่งเป็นวิธีตรวจหาอินเตอร์เฟียรอนแกมมา (IFN) ที่มีการหลั่งออกมาจากทีลิมโฟไซต์ชนิด memory หลังถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนจำเพาะของ M.tb งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์ที่จะพัฒนาวิธี IGRA ให้ใช้งานได้ง่ายกว่าที่มีอยู่เดิม โดยการคัดกรองเพปไทด์สังเคราะห์ของโปรตีน early secreted antigenic target 6 kDa (ESAT6) และ culture filtrate protein 10 kDa (CFP10) ที่สามารถกระตุ้นการหลั่ง eIFN ของเซลล์เม็ดเลือดขาวของช้าง และพัฒนาวิธีการตรวจโดยการกระตุ้นแบบ whole blood culture โดยเริ่มทำการตรวจการติดเชื้อของช้างด้วยวิธี IGRA เดิม (IGRA โดยใช้เซลล์เม็ดเลือดขาว PBMCs) ในตัวอย่างเลือดจากช้าง 20 เชือก โดยมีโปรตีนทั้งสายเป็นแอนติเจน พบว่าช้างมีการติดเชื้อ MTBC 50% ของตัวอย่างทั้งหมด ไม่ติดเชื้อ 30% และ 20% มีการติดเชื้อกลุ่ม Non tuberculous mycobacterium (NTM) จากนั้นทำการคัดกรองเพปไทด์สังเคราะห์ของโปรตีน ESAT6 และ CFP10 ในช้างทั้ง 20 เชือก พบว่าเพปไทด์สังเคราะห์ของโปรตีน ESAT6 และ CFP10 ที่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวของช้างที่คาดว่าติดเชื้อ MTBC ให้หลั่ง eIFN ได้ มีจำนวน 13 สาย และ 14 สาย ตามลำดับ สำหรับการพัฒนา IGRA ด้วยการกระตุ้นแบบ whole blood culture พบว่าสามารถใช้ Pokeweed (PWM) (10 ไมโครกรัมต่อมิลลิตร) เป็นสารกระตุ้นในกลุ่มควบคุมบวก และพบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนของ ESAT6 และ CFP10 (20 ไมโครกรัมต่อมิลลิตร) สามารถกระตุ้นการหลั่ง IFN ได้ แต่กลุ่มของเพปไทด์ที่คัดกรองได้จากการกระตุ้นแบบ PBMC culture นั้น ไม่สามารถกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวได้ด้วยการกระตุ้นแบบ whole blood culture ผลการศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า การกระตุ้นแบบ whole blood culture โดยใช้แอนติเจนทั้งสายของโปรตีน ESAT6 และ CFP10 สามารถใช้เป็นวิธีทางเลือกสำหรับการวินิจฉัยวัณโรคในช้าง ซึ่งเป็นวิธีที่ง่ายต่อผู้ใช้งาน และรวดเร็วกว่าการวินิจฉัยด้วย PBMCs IGRA
Other Abstract:	Tuberculosis (TB) is a zoonotic disease that can be transmitted between animals and humans. Wild animals such as non-human primates, mammals, including elephants can be infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tb) complex (MTBC) and may develop disease. TB in elephants are often latent but the clinical symptoms can be observed at the advanced stage. TB diagnostic in elephants is difficult because of the body size and their thick skin. Therefore, common TB diagnostic approaches used in human, such as chest X-ray and tuberculin skin test are not applicate. Moreover, the gold standard of bacteria culture from elephant trunk wash, has low sensitivity, time-consuming and can only detect TB in the active stage. Thus, an accurate diagnosis covering all phases of the M. tb infection is still needed. Interferon gamma release assay (IGRA) is an alternative approach for TB diagnosis, which detects the interferon gamma (IFN) secreted from memory T cell stimulated with specific M. tb antigens. The aims of this study is to screen the overlapping peptides of early secreted antigenic target 6 kDa (ESAT6) and culture filtrate protein 10 kDa (CFP10) from M. tb to use as MTB specific antigens in whole blood culture for IGRA. Using our in-house IGRA, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 20 elephants were tested by using whole protein antigens. Half of these samples were determined as infection positive with MTBC, 30% were infection negative, and 20% showed infection positive with Non tuberculous mycobacterium (NTM). When PBMCs from these 20 elephants were screened using the overlapping peptides from ESAT6 (21 peptides) and CFP10 (23 peptides), 13 peptides of ESAT6 and 14 peptides of CFP10 were identified as potential epitopes that were able to induce eIFN production from PBMCs of MTBC infected elephants. To perform whole blood culture IGRA, Pokeweed mitogen (10 ug/ml) were investigated and was chosen as mitogen for stimulation as the positive control. Recombinant whole protein of ESAT6 and CFP10 (20 ug/ml) were tested in MTBC positive samples and were found to yield consistent result as the PBMCs culture method. In contrast, overlapping peptides identified from PBMCs study did not yield the response from the whole blood culture. These results indicated that the whole blood culture using whole protein of ESAT6 and CFP10 can be used to identity MTB infection in elephant which Is much more user friendly and less time consuming than the PBMCs IGRA.
Description:	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2564
Degree Name:	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level:	ปริญญาโท
Degree Discipline:	เทคโนโลยีชีวภาพ
URI:	https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/84393
Type:	Thesis
Appears in Collections:	FACULTY OF SCIENCE - THESIS

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
6172122523.pdf		2.67 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record