Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/47124
| Title: | การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 |
| Other Titles: | Purification and characterization of inulinase from Streptomyces sp. CP01 |
| Authors: | นิโรบล เหลากลม |
| Advisors: | ไพเราะ ปิ่นพานิชการ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | ppairoh@chula.ac.th |
| Subjects: | อินูลิน สเตรปโตมัยซิส Inulin Streptomyces |
| Issue Date: | 2554 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | งานวิจัยนี้ศึกษาการทำอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 ให้บริสุทธิ์โดยเลี้ยงเชื้อในอาหารเหลวที่มีอินนูลินสกัดจากรากแก่นตะวันเป็นแหล่งคาร์บอน นำน้ำเลี้ยงเชื้อมาตกตะกอนลำดับส่วนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตความเข้มข้ม 40-80 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยการทำคอลัมน์โครมาโทกราฟีสี่ขั้นตอน คือแมคโคร-เพรบดีอีเออี เซฟาคริลเอส-200เอชอาร์ ที-บิวทิลไฮโดรโฟบิคอินเตอร์แอคชัน และไฮดรอกซีอะปาไทด์ ได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นประมาณ 67 เท่า จากการวิเคราะห์น้ำหนักโมเลกุลโดยวิธีเจลฟิลเตรชันพบว่าเอนไซม์นี้มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 73 กิโลดาลตัน และเมื่อวิเคราะห์โดยวิธีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตพอลิอะคริลาไมด์เจลอีเลคโทรโฟริซิสมีน้ำหนักโมเลกุลใกล้เคียงกันคือ 70.8 กิโลดาลตัน จากการศึกษาสมบัติของอินูลิเนสบริสุทธิ์พบว่าเอนไซม์มีอุณหภูมิและความเป็นกรดด่างที่เหมาะสมต่อการทำงาน คือ 55 องศาเซลเซียส และ 6.0 ตามลำดับ เอนไซม์มีความเสถียรต่ออุณหภูมิสูงถึง 50 องศาเซลเซียส และเสถียรต่อความเป็นกรดด่างในช่วงกว้างตั้งแต่ 6.0-9.0 เป็นเวลา 30 นาที จากการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยอินนูลินโดยวิธีโครมาโทกราฟฟีแบบแผ่นบางพบว่าเอนไซม์นี้เป็นเอนโดอินูลิเนส สำหรับ ค่า Km ต่ออินนูลินและซูโครส เท่ากับ 2.36 และ 40 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ และค่า Vmaxต่ออินนูลินและซูโครส เท่ากับ 440 และ 12.3 ไมโครโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัม ตามลำดับ นอกจากนี้พบว่าสารดัดแปลงกรดอะมิโน ได้แก่ เอ็น-โบรโมซัคซินิไมด์และไอโอโดอะเซตะไมด์มีผลยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์ แสดงว่ากรดอะมิโนทริปโตเฟนและซีสเทอีนน่าจะเกี่ยวข้องกับบริเวณ active site ของเอนไซม์ |
| Other Abstract: | Inulinase was purified from the culture filtrate of Streptomyces sp. CP01 grown in liquid medium containing inulin extract from Jerusalem artichoke as a carbon source. The enzyme was purified to approximately 67 fold-purity by fractionation with 40-80% saturation of ammonium sulfate followed by four consecutive column chromatography steps on Macro-prep DEAE, Sephacryl S-200, t-butyl hydrophobic interaction and hydroxyapatite, respectively. The apparent molecular weight of the purified enzyme was 73 kDa as estimated by gel filtration and 70.8 kDa estimated by SDS-PAGE. The purified enzyme is optimally active at 55 C and pH 6.0. It is stable at temperature up to 50 C and at a broad range of pH from 6.0-9.0 after 30 min. Analysis of inulin hydrolysis- products by thin layer chromatography indicated that this enzyme is endoinulinase. Its Km values for inulin and sucrose were 2.36 and 40 mM, respectively, and its Vmax values are 440 and 12.3 mM/min/mg, respectively. When the enzyme was treated with N-bromosuccinimide and iodoacetamide, amino acid modifying agents, its activity was reduced indicating tryptophan and cystein may involve in the active site of the enzyme. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2554 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/47124 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2011.2039 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2011.2039 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| nirobol_la.pdf | 78.95 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.