Detection of Chalamydia trachomatis by Polymerase chain reaction

Abstract

เพื่อการตรวจหา Chlamydia trachomat is อย่างรวดเร็ว ด้วยวิธี polymerase chain reaction (PCR) ได้ใช้ oligonucleotide primers เพิ่มจำนวนชิ้นส่วนขนาด 621-bp ของ pCHL2 ซึ่งเป็น plasmid DNA ที่พบได้ใน C. trachomatis ทุกสายพันธุ์ ป้องกันการเกิดผลบวกปลอมเนื่องจาก amplicon carryover โดยใช้ dUTP แทน dTTP และเติม uracil DNA glycosy-lase (UDG) ลงในส่วนผสมของปฏิกิริยา ตรวจหา amplified product บน agarose gel ซึ่งมี ethidium bromide ผสมอยู่ และพิสูจน์ยืนยันด้วย dot blot hybridization โดยใช้ 473-bp biotin-labelled probe เป็นตัวติดตาม จากผลการวิจัยพบว่าสามารถตรวจหา pCHL2 DNA ได้น้อยที่สุดเท่ากับ 2 fg ซึ่งเทียบเท่ากับ 243 copies ของ pCHL2 DNA ที่พบใน C. trachomatis จำนวน 24 elementary body กลุ่มตัวอย่างที่ใช้ทดสอบประสิทธิภาพของ PCR ในการตรวจหา C. trachomatis จากสิ่งส่งตรวจของผู้ป่วยคือ endocervical swab ของผู้ป่วยหญิงที่มารับการตรวจที่คลินิกโรคติอต่อทางเพศสัมพันธ์จำวนวร 100 ราย นำมาตรวจหา C. trachomatis โดยใช้วิธี PCR และ cell culture ก่อนทำการทดสอบด้วยวิธี PCR นำสิ่งตรวจที่ได้รับมาปั่นตกตะกอน นำส่วนของตะกอนมาละลายใน lysis buffer ซึ่งประกอบด้วย nonidet p-40 , tween 20 และ proteinase K ที่อุณหภูมิ 60 ซ 1 ชั่วโมง ต่อจากนั้นนำไปต้มนาน 10 นาที แบ่งตัวอย่างที่ได้จำนวน 5 ul มาทำ PCR และเติม pCHL2 DNA ลงในตัวอย่างอีกส่วนหนึ่ง เป็น control เพื่อตรวจหา amplification inhibitor ในสิ่งส่งตรวจ เมื่อเปรียบเทียบผลการตรวจหา C. trachomatis จาก endocervical specimen จำนวน 100 ตัวอย่างโดยวิธี PCR กับ cell culture พบว่า PCR ให้ผลบวกกับสิ่งส่งตรวจทั้ง 12 ตัวอย่างที่ให้ผลบวกโดยวิธี cell culture และสามารถตรวจหา C. trachomatis ได้จากสิ่งส่งตรวจ 2 ใน 88 ตัวอย่างที่ให้ผลลบโดยวิธี cell culture เมื่อนำสิ่งส่งตรวจทั้งสองตัวอย่างที่ PCR ให้ผลบวกแต่ cell culture ให้ผลลบ มาตรวจหา C. trachomatis โดยใช้ Gen-Probe Pace 2 system ( Gen-Probe, Inc. , San Diego, CA) พบว่าทั้งสองตัวอย่างให้ผลบวก ผลการทดลองดังกล่าวแสดงให้เห็นว่า PCR เป็นวิธีการตรวจหา C. trachomatis จากสิ่งส่งตรวจของผู้ป่วยแบบรวดเร็ววิธีหนึ่งที่มีความไวและความจำเพาะสูง